Экспресс-тесты Singlepath и Duopath

Аналоги других производителей

Экспресс-тест для определения сальмонелл

подробнее

подробнее

Singlepath-Salmonella

Экспресс-тесты на патогены Singlepath^® и Duopath^® производства фирмы Merck Milliopore предназначены для выявления бактерий рода Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E.coli O157, Campylobacter, Legionella spp., Legionella pneumophila, энтеротоксигенные штаммы Bacillus cereus, а также веротоксинов VТ1 и VТ2 (шигоподобные токсины I и II типов энтерогеморрагических E.coli).

С использованием иммунохроматографических экспресс тестов на поатогены производства Merck Millipore стало возможным быстро и надежно выявить наличие или отсутствие основных патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и окружающей среде. С помощью этого простого теста можно получить результат уже через 20 минут. Это позволяет существенно сократить время исследования. Тест не уступает по надежности классическому методу.

Определение патогенных микроорганизмов с помощью Singlepath-тестов основано на методе визуальной иммунохроматографии (разновидность ИФА).  Тест представляет собой диагностическую панель с лункой для добавления обогащенного образца, контрольной (С) и тестовой (Т) зоной. Антигены определяемых бактерий, присутствующие в образце, взаимодей­ствуют с меченными золотом антителами, включенными в состав теста, с образованием окрашенного комплекса антиген-антитело. Окрашенный комплекс связывается с иммобилизованными антителами с образованием линий в тестовом и контрольном окнах.

Singlepath^® и Duopath^® экспресс тесты на патогены одобрены ФГУЗ Центром Гигиены и Эпидемиологии Роспотребнадзора (МР №24ФЦ/976) и разрешен к применению в лабораториях санитарно-эпидемиологической службы, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в производственных лабораториях. Singlepath^® и Duopath^® - высокочувствительный, специфичный, удобный и надежный тест, используемый для скрининга патогенных микроорганизмов в продуктах питания и окружающей среде.

Преимущества:
- Экспрессность. Результат через 20 минут.
- Надежность. Высокая чувствительность и специфичность  метода (99%). Ясный и четкий положительный или отрицательный результат. Встроенный положительный контроль. 
- Легко использовать. Нет необходимости в ходе исследо­вания добавлять какие-либо реагенты. Все компоненты включены в одну тест-пластинку. Отсутствуют сложные этапы в исследовании. Одноэтапный формат теста исключает возможные ошибки.
- Удобный. Необходимо добавить образец и учесть результат.
- Экономичный. Сокращает время исследования, снижает трудозатраты, уменьшает количество пересевов.
- Нет необходимости приобретать и обслуживать дорогостоящее оборудование.

Singlepath и Duopath

Экспресс-тесты Singlepath и Duopath для выявления патогенных микроорганизмов и токсинов в пищевых продуктах

Cтатья в журнале "Молочная промышленность", №1, 2015
Д.М. Соколов, М.С. Соколов, ООО «МикроБио»

Введение
Инфекционные заболевания во всем мире прочно занимают первое место в структуре заболеваемости населения. Среди них одна из лидирующих позиций принадлежит острым кишечным инфекциям (ОКИ). Тенденция роста ОКИ характерна для всех стран, включая и Россию. По официальным данным заболеваемость ОКИ в России за период 1999–2009 гг. выросла в 7 раз. В структуре вспышечной заболеваемости ведущее место принадлежит сальмонеллезу и кампилобактериозу. Постоянно растет заболеваемость шигеллезами и эшерихиозами. Среди эшерихиозов особое значение приобрел энтерогемморагический колит с высокой летальностью, причиной которого являются E.coli О157 и некоторые другие серотипы кишечной палочки, способные продуцировать  веротоксины. Повышенная заболеваемость ОКИ в развивающихся странах связана с быстрым ростом и скученностью населения, низкими уровнями санитарной культуры, качества пищи и воды. В развитых странах основными причинами вспышек кишечных инфекций являются грубейшие нарушения технологического процесса на предприятиях пищевой промышленности, а также в сфере водоподготовки и водоотведения. Для снижения уровня заболеваемости ОКИ ключевое значение приобретает санитарно-микробиологический контроль воды, сырья и готовых продуктов питания на всех этапах производства и реализации. Масштабность и динамичность современного производства пищевых продуктов и технологий водоочистки требуют эффективных методов санитарного контроля, позволяющих принимать своевременные решения. Культуральный бактериологический метод в своем классическом чашечном варианте все меньше соответствует требованиям современного производства из-за продолжительности и трудоемкости.

Экспресс-методы диагностики
Основными современными методами экспресс-диагностики возбудителей являются иммунологические и молекулярные методы детекции. В основе молекулярных методов лежит амплификация короткого участка ДНК или РНК, уникального для целевого возбудителя. Этот участок-мишень распознается с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров (затравок) и многократно копируется (амплифицируется) комплексом ферментов. Одним из наиболее распространенных методов амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Экспресс-методы, основанные на иммунологических реакциях, направлены на поиск в исследуемом материале специфических антигенов микроорганизмов (белков, гликопротеидов, липопротеидов, гликолипидов). Наиболее распространенным методом иммунодиагностики является иммуноферментный анализ (ИФА). ПЦР и ИФА, обладая несомненными преимуществами, такими как относительная простота выполнения, быстрота и объективность (за счет автоматизации учета результатов), тем не менее имеют ряд недостатков, что не позволяет полностью заменить ими бактериологический метод. Следует отметить, что обнаружение антигенов или ДНК патогенных микроорганизмов в исследуемом материале не дает информации об их жизнеспособности, так как указанные соединения будут определяться и после гибели клеток. Кроме того, эти методы на несколько порядков уступают бактериологическому методу по чувствительности и не подходят для исследования образцов с низкими уровнями контаминации. Данные методы исследования требуют высокотехнологичного оборудования, комплекса помещений и высококвалифицированного персонала (табл. 1).

Тест-системы для ускоренной диагностики
Рациональное и простое решение предложила компания Merck KGaA (Германия), выпустив диагностические тест-системы Singlepath® и Duopath® для обнаружения патогенных микроорганизмов и токсинов (табл. 2). Эти тест-системы сочетают высокую чувствительность бактериологического метода с оперативностью и высокой специфичностью иммунологического метода, что позволяет ускорить классический бактериологический анализ без потерь чувствительности и оценки жизнеспособности. Вначале исследуемый образец подвергается обогащению в селективной среде. Этот этап является элементом бактериологического метода. С одной стороны, он увеличивает количество искомых микроорганизмов до детектируемого уровня, а с другой – подтверждает жизнеспособность исследуемых клеток патогена, которые смогли размножиться в среде обогащения. На втором этапе осуществляется индикация целевых микроорганизмов в обогащенной культуре при помощи иммунологической тест-системы. В ее основе лежит иммунохроматографический метод исследования, который давно уже получил широкое распространение в клинической практике.

Иммунохроматографический анализ
Иммунохроматографический анализ (ИХА) является разновидностью иммуноферментного метода с мечеными компонентами. В ИФА антитела к искомым антигенам метятся ферментом, а в ИХА – коллоидным золотом. Каждый из вариантов имеет свои преимущества. Метка ферментом повышает чувствительность реакции за счет активности самого фермента, усиливающего индикацию положительного результата. Чувствительность ИФА находится в пределах 10²–10⁵КОЕ/мл [4]. Недостатками такой системы являются необходимость инструментального учета результата при помощи специального планшетного фотоколориметра и более сложная методика выполнения, включающая приготовление растворов, внесение нескольких реагентов, многократные промывки и инкубацию в термостате [4]. ИХА обладает меньшей чувствительностью из-за неактивной метки (10⁴–10⁸ КОЕ/мл [5]), но при этом крайне прост в исполнении, а учет результата осуществляется визуально и не требует наличия сложных дорогих приборов и высокой квалификации исполнителя. Иммунохроматографический тест Singlepath® (рис. 1) содержит полоску пористого материала, обеспечивающего распространение жидкости. В зоне внесения исследуемого материала (круглая лунка) полоска пропитана мечеными антителами к искомому антигену. Кроме того, в определенных местах (T и C) нанесены еще две полосы немеченых иммобилизованных антител. Полоса T соответствует тестовой зоне и содержит антитела к искомому антигену, а полоса C–контрольной зоне и содержит антитела, способные связывать меченые антитела из зоны нанесения материала. Жидкий исследуемый материал вносится в специальную лунку, растворяет меченые антитела, которые вместе стоком жидкости движутся к противоположному концу тест-системы. При наличии в материале искомого антигена они связываются с ним и дальше движутся уже в составе комплекса антиген–антитело. При прохождении тестовой зоны иммобилизованные антитела связываются с комплексом антиген–антитело, образуя так называемый «сэндвич». Благодаря его формированию меченые антитела задерживаются в тестовой зоне, и образуется окрашенная полоска. Не связавшийся избыток меченых антител при прохождении контрольной зоны (С) связывается с иммобилизованными антителами контрольной зоны, образуя комплекс. Благодаря фиксации меченых антител в контрольной зоне также образуется окрашенная полоска, подтверждающая работоспособность тест-системы. Таким образом, в случае положительного результата образуются две полосы: в тестовой и контрольной зоне. При отрицательном результате (отсутствие искомого антигена) меченые антитела, не задерживаясь в тестовой зоне, сразу мигрируют в контрольную зону, где связываются с иммобилизованными антителами, образуя только одну полосу в зоне С.

В системах Duopath®, которые предназначены для идентификации сразу двух антигенов, в зоне нанесения исследуемого материала находится смесь двух антител и соответственно имеются две тестовые зоны для каждого антигена. Во всем остальном системы идентичны. Таким образом, благодаря применению в системах Singlepath® и Duopath® иммунохроматографического метода выполнение анализа и учет результатов крайне упрощаются и не требуют ни высокотехнологичного оборудования, ни высококвалифицированного персонала. При этом относительно низкая чувствительность ИХА компенсируется этапом обогащения, который позволяет исследовать образцы с низкими уровнями контаминации и подтверждает жизнеспособность исследуемых объектов.

Варианты использования ИХА-тестов
Тест-системы Singlepath® и Duopath® можно использовать как самостоятельные и как элемент классического бактериологического метода. В последнем случае ИХА тесты используются для оценки наличия целевых микроорганизмов в обогащенном материале, что позволяет ускорить выдачу отрицательного результата или дать предварительный положительный ответ (рис. 2). ИХА-тесты можно также использовать для ускоренной идентификации колоний, выделенных при высеве обогащенной смеси на плотные селективные среды [2].

Валидация и сертификация тест-систем Singlepath и Duopath

Эффективность тест-систем Singlepath и Duopath многократно подтверждена сравнительными испытаниями с классическими методами исследования [6–8]. После проведения независимых испытаний [5] авторитетная международная организация AOAC Research Institute сертифицировала тест-системы Singlepath и Duopath: Singlepath Salmonella (сертификат №060401); Singlepath E.coli O157 (сертификат №010407); Singlepath Campylobacter (сертификат № 120401); Duopath Verotoxin (сертификат № 020402). Тест-системы Singlepath и Duopath получили признание в Российской Федерации, их применение регламентировано рядом документов. Использование ИХА-тестов Singlepath и Duopath как этапа, ускоряющего классический бактериологический метод определения сальмонелл, Listeria monocytogenes, энтерогемморагической E.coli О157 и кампилобактера, нашло отражение в Методических рекомендациях Федерального центра Госсанэпиднадзора РФ № 24ФЦ/976 [2]. Кроме того, использование тест-систем Singlepath E.coli O157 и Duopath Verotoxins регламентировано в МУК4.2.2963-11 [3], а Singlepath Listeria mono – в ГОСТ 32031–2012 [1].

Выводы.
Тест-системы Singlepath и Duopath производства Merck KGaA – это разрешенный к применению в РФ, экономичный, высокоспецифичный и достаточно чувствительный (в сочетании с обогащением) метод выявления патогенных микроорганизмов. Метод не требует сложного оборудования, высококвалифицированного персонала, является быстрым, надежным и удобным, благодаря чему может использоваться самостоятельно или как составная часть бактериологического метода. Тест-системы Singlepath и Duopath обеспечивают ускоренное получение отрицательного ответа и сокращают время идентификации патогенных микроорганизмов.

Список литературы
1. ГОСТ 32031–2012 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes».
2. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия): методические рекомендации № 24ФЦ/976. – М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.–23 с.
3. МУК 4.2.2963-11 «Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах».
4. Определение бактерий рода Salmonella методом твердофазного иммуноферментного анализа: методические рекомендации № 02.013-06. – М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2006.
5. Thompson L., Lindhardt Ch. Singlepath® Salmonella // Journal of AOAC International. 2006. V. 89. No 2. P. 417–432.
6. www.merckmillipore.com. «Singlepath® E. coli O157: Detection of E. coli O157 in 375g samples of ground beef and beef trim using Rapidcult E. coli».
7. www.merckmillipore.com. «Singlepath® L’mono and Singlepath® Listeria: Confirmation assay».
8. www.merckmillipore.com. «Singlepath® Emetic Tox Mrk for the qualitative detection of Bacillus cereus Emetic Toxin Marker».