Инструкция

Экспресс-тест для определения энтерогеморрагических E.coli - Duopath^® Verotoxins

Кат.№1.04144.0001
Упаковка - 25 тестов

Duopath^® Verotoxins – это иммунохроматографический экспресс-тест, который выявляет наличие веротоксинов (шигаподных токсинов), продуцируемых энтерогеморрагическими (EHEC) патогенными штаммами Е.coli (включая E.coli O157:H7), при выделении из пищевых продуктов. Кроме того, тест Duopath^® Verotoxins широко используется в клинических лабораториях для идентификации веротоксинов VT1 и VT2, продуцируемых штаммами EHEC, выделенными из клинического материала (фекалии).

Введение
Среди штаммов Е.coli особое значение имеют патогенные штаммы, синтезирующие веротоксины (шигаподобные токсины). Выделяется группа энтерогеморрагических штаммов Е.coli (EHEC) с высокопатогенными сероварами O157:Н7, O26, O103, O111, O145 и др. Продукция веротоксинов является наиболее общий критерием для определения данной группы бактерий. Веротоксины можно классифицировать по основным группам: веротоксины 1 (VT1, SLT1, Stx1) и веротоксины 2 (VT2, SLT2, Stx2). Штаммы EHEC способны продуцировать либо только токсины первой (VT1) или второй группы (VT2), либо обе группы токсинов (VT1) и (VT2) одновременно. Штаммы EHEC представляют серьезную угрозу жизни особенно для пожилых людей и детей.

Резервуаром данной инфекции являются фекалии крупного рогатого скота, коз и овец. Загрязнение пищевых продуктов происходит в процессе их приготовления при неудовлетворительном состоянии гигиены на производстве, а также при недостаточной термической обработке продуктов.

Необходимо уметь быстро и надежно выявлять наличие энтерогеморрагических E.coli в пищевых продуктах. Метод выявления E.coli O157:H7 с использованием экспресс-теста Duopath^® Verotoxins позволяет дать ответ уже через 20 минут после этапа селективного обогащения.

Принцип действия
Экспресс-тест Duopath^® Verotoxins – это иммунохроматографический тест с использованием меченных золотом антител. Тест Duopath^® Verotoxins представляет собой диагностическую тест-панель с круглой лункой для добавления образца, овальным окном с тестовыми зонами (VТ1) и (VT2) и контрольной (С) зоной.

1) Образец добавляется в круглую лунку.
2) Образец адсорбируется подложкой и взаимодействует со специфичными к веротоксинам (VT1) и (VT2) антителами.
3) В присутствии антигенов (веротоксинов) образуется комплекс с меченными антителами, который мигрирует до зоны связывания в тестовой зоне (VT1) и (VT2).
4) Зоны связывания (VT1) и (VT2) содержат соответствующие антитела к комплексу антиген-антитело. В результате образуется четкая красная линия в одной зоне (VT1) (наличие веротоксинов группы 1) или в другой зоне (VT2) (наличие веротоксинов группы 2) или в двух зонах сразу при наличии веротоксинов обеих групп (VT1) и (VT2).
5) Оставшийся образец продолжает движение к контрольной зоне (С) и образует четкую красную линию, указывающую на то, что тест работает правильно.

Чувствительность метода – нижний предел обнаружения веротоксинов составляет 25 нг/мл для веротоксинов группы 1 (VT1) и 62,5 нг/мл для веротоксинов группы 2 (VT2).

Условия хранения
Duopath^® Verotoxins стабилен до даты, указанной на упаковке, при хранении в условиях +2-8^оС.

Проведение анализа

Выявление энтерогеморрагических E.coli в образцах пищевых продуктов
1) Смешать 25 г (мл) образца с 225 мл среды обогащения. Выбор среды обогащения зависит от типа продукта. Среда для молочных продуктов – модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином Кат.№1.09205.0500. Среда для мясных продуктов - модифицированный бульон ЕС с новобиоцином, Кат.№1.14582.0500). При необходимости гомогенизировать образец. Инкубировать триптиказо-соевый бульон с новобиоцином в течение 18-24 ч при 37^оС, а модифицированный бульон ЕС с новобиоцином в течение18-24 ч при 41,5^оС.
2) Со среды обогащения посеять на SMAC агар и CT-SMAC агар и инкубировать в течение 18-24 ч при 37^оС.
3) Выбрать 1-5 характерные колонии E.coli со SMAC агара или CT-SMAC агара.
4) Ресуспендировать колонии в 1 мл CAYE-бульона с добавкой (индуктор синтеза веротоксинов).
5) Инкубировать в течение 6 часов при 37^оС.
6) Перенести 180 мкл культуральной жидкости CAYE-бульона в пластиковую пробирку (эппендорф).
7) К флакону с полимиксином В (Кат.№1.09875.0001) добавить 1 мл стерильной дистиллированной воды.
8) Добавить 20 мкл раствора полимиксина В к 180 мкл культуральной жидкости с CAYE-бульоном и перемешать. Инкубировать в течение 10 минут при 37^оС.
9) Дать остыть до комнатной температуры.

Примечание. На CT-SMAC агаре способны расти только штаммы E.coli O157. Для определения синтеза веротоксинов от других сероваров E.coli, CT-SMAC агар должен быть заменен на SMAC агар или BHI агар (агар с сердечно-мозговой вытяжкой).

Duopath-тестирование
1) Перед использованием обогащенный образец и тест Duopath^® Verotoxins должны быть комнатной температуры (обычно тесты хранятся в холодильнике).
2) Вскрыть пакет из фольги, в который упакован Duopath^® тест. Положить Duopath^® тест на ровную поверхность и отмаркировать (указать номер исследуемого образца). Тестирование должно быть проведено в течение 2 часов после вскрытия фольги!
3) Используя микропипетку и одноразовый наконечник, добавить 150 мкл охлажденной культуральной жидкости в круглую лунку для образца.
4) Считать результаты через 20 минут после добавления образца.

Интерпретация результатов
1) Результаты теста учитываются только при наличии четкой красной линии в контрольной зоне (С) через 20 минут.
2) Образец считается положительным, если после 20 минут или ранее красные линии образовались как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной (С) зоне.
3) Образец считается отрицательным, если красная линия отсутствует в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), но присутствует в контрольной зоне (С).
4) Тест следует повторить, если красные линии отсутствуют как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной зоне (С) через 20 минут.

Выявление энтерогеморрагических E.coli из клинического материала
1) Посеять клинический материал (фекалии) на среду SMAC агар (без селективной добавки) и инкубировать 18-24 часа при 37^оС.
2) Снять тампоном выросшие на агаре колонии, пересекая несколько раз зону сливного роста.
3) Ресуспендировать колонии в 1 мл CAYE-бульона с добавкой (индуктор синтеза веротоксинов). Инкубировать в течение 6 часов при 37^оС.
4) Перенести 180 мкл культуральной жидкости CAYE-бульона в пластиковую пробирку (эппендорф).
5) К флакону с полимиксином В (Кат.№1.09875.0001) добавить 1 мл стерильной дистиллированной воды. Добавить 20 мкл раствора полимиксина В к 180 мкл культуральной жидкости с CAYE-бульоном и перемешать. Инкубировать в течение 10 минут при 37^оС.
6) Дать остыть до комнатной температуры.