Инструкция

ENTEROTUBE II

II - это готовая к использованию тест-система для идентификации Enterobacteriaceae. Специальные среды, помещенные в отдельные отсеки прозрачной пластиковой трубки, позволяют одновременно определить 15 различных биохимических характеристик бактерий. Все отсеки инокулируются одновременно и идентифицируются после приблизительно 24 часов инкубации.

ПРИНЦИП И ПРИМЕНЕНИЕ:

II и его компьютерно-кодирующая и идентификационная система (CCIS) специально разработаны для идентификации энтеробактерий,

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ <ENTEROTUBE> II:

II рекомендуется использовать для  характеристики изолированных колоний грамотрицательных, отрицательных в тесте с оксидазой бактерий.

Для выращивания энтеробактерий используются следующие среды:

            Агар Мак-Конки (MC Roche)

            Агар Эндо

            Эозин-Метиленовый синий Агар

            Salmonella-Shigella Агар,

ИНСТРУКЦИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ:

1. Удалите обе крышки. Кончик иглы находится под белой крышкой. Без прокаливания иглы наберите хорошо изолированную колонию прямо на острие иглы. Не прокалывайте агар.
2. ИнокулируйтеII, протягивая иглу через все отсеки и одновременно вращая ее. Вставьте иглу обратно (не стерилизуя) так, чтобы надпил на игле совпадал с краем трубки. Конец иглы должен быть виден в цитратном отсеке.
3. Обломите иглу в месте надпила. Кусок иглы оставшийся в трубке поддерживает анаэробные условия, необходимые для ферментации глюкозы, декарбоксиляции лизина и орнитина и фиксирования газообразных продуктов.
4. Обломком иглы проколите пленку, закрывающую последние восемь отсеков (адонитол, лактоза, арабиноза, сорбитол, VP, дульцитол/PA, и цитрат) для поддержания аэробного роста в этих отсеках. Закройте обе крышки.
5. Инкубацию проводите при 35-37°С, держа трубку по возможности вертикально (например, в специальном штативе для тестовых трубок) отсеком "глюкоза" вверх, или горизонтально, положив ее на плоскую сторону. Время инкубации: 20-24 часа.
6. Проведите анализ всех, за исключением индола и VP, реакций, сравниваяII с рисунком или неинокулированной трубкой. Запишите результаты на интерпретационной полоске. Реакция отрицательна, если отсек остался неизменным (за исключением индола и VP).
7. Для проведения индол-теста положитеII плоской поверхностью вверх на стол или подставку. Впрысните 3-4 капли реагента Ковача прямо под пластиковую пленку отсека H2S/indole.
8. Реакция положительна, в случае проявления красного цвета в добавленном реагенте в течение нескольких секунд.
9. Для проведения VP-теста впрысните 3 капли раствора альфа-нафтола (реагент 1) и 2 капли гидроксида калия (реагент 2) в воздушную прослойку VP-отсека расположенной горизонтальноII. Реакция положительна, в случае образования красного цвета в добавленном реагенте в течение 10 минут.

При необходимости проведения дальнейших тестов или проверки чистоты, культура может быть перенесена из выдержаннойII в нужную среду или бульон. Для этого достаточно провести по чашке Петри вынутой из трубки стерильным пинцетом иглой. Среда с бактериями также может быть экстрагирована из отсека с положительной реакцией стерильной петлей после удаления пластиковой пленки.

РЕАКЦИИ:

Glucose

Воск, закрывающий этот отсек, в нужной степени обеспечивает анаэробные условия только для действительной реакции ферментации, характеризующей все энтеробактерии. Если отсек остается красным, то организм не принадлежит к энтеробактериям. О положительной ферментации свидетельствует желтый цвет, который также подтверждает полное обсеменениеII. Оранжевый цвет - отрицательный результат.

Gas

О выделении газа свидетельствует подъем воска либо его отделение от поверхности агара, а также отделение агара от оболочки трубки. Т.к. количество выделяемого бактериями газа может варьировать, расстояние между агаром и оболочкой тоже может меняться. Отдельные маленькие пузырьки в агаре не являются признаком выделения газа.

Lysine

Бактериальное декарбоксилирование лизина, приводящее к образованию алкилинового конечного продукта кадаверина, проявляется в изменении цвета индикатора с желтого на фиолетовый. Восковое покрытие обеспечивает анаэробные условия необходимые для избежания ложно положительной реакции.

Ornithine

Бактериальное декарбоксилирование орнитина, приводящее к образованию алкилинового конечного продукта путресцина, проявляется в изменении цвета индикатора с желтого на фиолетовый. Восковое покрытие обеспечивает анаэробные условия необходимые для избежания ложно положительной реакции.

H2S

Образование сероводорода проявляется в возникновении ионов железа в форме нерастворимого черного налета сульфида железа.

В случае Salmonella черный налет на игле может быть очень тонким.

Proteus и Providencia могут быть причиной окраски среды в коричневый цвет. Это явление не служит, однако, свидетельством образования H2S.

Indole

Продуцирование индола в результате метаболизма триптофана проявляется в красной окраске реагента Ковача, который добавляется после инкубации.

Adonitol, Lactose, Arabinose, Sorbitol

В процессе выработки углеводородов образуются аданитол-, лактоз-, арабинозо- и сорбитолкислые продукты реакции. Оранжевый цвет - отрицательный результат.

Voges-Proscauer

Ацетилметилкарбинол является промежуточным продуктом в ферментации глюкозы и обнаруживается с помощью реагентов Voges-Proscauer. Положительная реакция проявляется в течение 10 минут в красной окраске добавленных реагентов.

Dulcitol-PA

Выделение бактериями дулцитола является причиной кислотности, признаком которой служит изменение цвета индикатора с зеленого на желтый.  Все организмы дающие положительную реакцию на дулцитол имеют отрицательную реакцию на фенилаланин (PA). Поэтому невозможна одновременно положительная реакция на дулцитол и фенилаланин. Этот тест обнаруживает образование пировинной кислоты из фенилаланина. Пировинная кислота взаимодействует с цитратом железистого аммония, находящимся в среде, и, в идеале, окрашивает среду в коричневый цвет или в коричнево-оливковый в некоторых случаях. Если после инкубации среда имеет зеленый цвет более темный, чем исходный, результат определяется как отрицательный.

Urea

В процессе гидролиза мочевины образуется аммоний, окрашивая среду из бурого цвета в пурпурный. Реакция резко положительна для штаммов Proteus, что становиться видно уже через 4-6 часов инкубации. Изредка она может быть слабо положительной (светло-розовый цвет) в случае Klebsiella и некоторых энтеробактерий.

Citrate

На этой среде, содержащей аммоний и цитрат, могут расти только те бактерии, которые могут использовать цитрат как единственный источник углерода и соли аммония как единственный источник азота. Даже слабый голубой оттенок является признаком положительной реакции.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ:

            Использованные II автоклавируйте либо сжигайте.

ХРАНЕНИЕ:

            Хранить при температуре 2-8°С, не замораживая. Срок хранения указан на упаковке.

а. Результаты:

Положительные или отрицательные результаты для 14 (15 с Vogs-Proscauer (VP)-реагентом) собираются в 5-ти значный профильный номер, который сверяется с идентификационными номерами в разделе Идентификационной базы кодовой книги (Identification database)

в. База данных:

Идентификационная база данных состоит из 3-х разделов.

1-я - ограниченная - для Оксидазо-негативных Глюкозо-неферментирующих

Гр(-) бацилл. Две остальные базы данных для Оксидазо-негативных Глюкозо-ферментирующих бацилл.  Результаты BBLII могут быть прочитаны с использованием и без использования Vogs-Proscauer (VP)-реакции (в 9 отсеке трубки).  VP-реакция может рассматриваться 1) как подтверждающий тест, если он рекомендуется в базе данных на стр.53 или 2) как прямой тест с включением в профильный номер - читается в базе данных на стр.95

Звездочка в базе данных (*) рядом с названием возбудителя означает редко встречающийся микроорганизм. Если выявлен редко встречающийся микроорганизм рекомендуется изолировать его и повторить инокуляцию в BBLII. Если результат подтверждается, но результат спорен - то есть велика вероятность, что это более распространенный вид - необходимо провести подтверждающие тесты.

Частота появления редких изолятов столь низка (часто реже, чем 1 раз в год), что непременно необходимо просмотреть любые вероятные ошибки - тщательно сверить окраску лунок.

В единичных случаях, когда полученный результат после рассмотрения атипичных тестов и подтверждающих тестов не имеет соответственного, вызывающего доверия решения, результат рассматривается как атипичный.

Когда возможен выбор из двух и более микроорганизмов при отсутствии атипичных тестов, необходимо провести подтверждающие тесты для окончательной идентификации. Идентификационная вероятность для каждого микроорганизма в данном случае также может быть проставлена как процент вероятности (%). Более высокий процент вероятности в данном случае свидетельствует о наиболее вероятном правильном выборе неизвестного микроорганизма.

Если выявленный результат отсутствует в кодовой книге:

1) Убедитесь, что биохимический профиль не содержит положительных результатов для обоих фенилаланинов - деаминазы и дульцитола. В данном случае интерпретация BBL II не возможна.

2) Убедитесь, что инокулят содержал чистую культуру. Если такая вероятность не исключена, неопходимо пересеять субкультуру из положительных BBL II для изоляции и повторить тест с хорошо изолированными колониями.

С. Подтверждающие тесты:

Когда одному идентификационному номеру соответствует два и более микроорганизмов, окончательный результат основывается на тестах, указанных в колонке “Подтверждающие тесты” (Confirmatory tests). Подтверждающие тесты обычно необходимы для идентификации редких биотипов, за исключением подтверждающих тестов с антисыворотками.

Аббревиатура подтверждающих тестов:

1.Серологическое типирование

ADA   Alcalescens-Dispar антисыворотка. Alcalescens-Dispar (A-D) группа включена как биотипы E.Coli. Они обычно неподвижны, лактоза-негативные и не образуют газа)

SHA   Shigella антисыворотка

SPA    Поливалентная Salmonella антисыворотка

Salmonella Typhi всегда должна подтверждаться серологическим типированием.

2. Углеводные ферментативные тесты.

CEL Целлобиоза          MAN Маннитол        RAF Раффиноза       TRE Трегалоза

GLY Глицерол             MEL Мелибиоза        RHA Рамноза           XYL  Ксилоза

INO  Инозитол            MLT  Мальтоза         SUC  Сахароза

Прочие тесты:

ARG                      Аргинин дигидролаза

ASC                      Аскорбат тест

CARBEN/CEPH       Карбенициллин (30мкг), Цефалоспорин (100мкг)

DNA                      ДНКаза

ESC                       Эскулин

JTR                       Среда Фенол красный тартрат

KCN                       Цианид калия

MAL                       Малонат

MOT                      Подвижность

ONP                      ONPG

PUNGENT ODOR     Запах гнилого ореха

VP                         Фогес-Проскауэр

YEL                       Желтый пигмент

Инструкции к вышеуказанным тестам и материалы по типированию антисыворотками предоставляются на коммерческой основе.

III. DIRECTION FOR USE

Рекомендации к использованию

BBLII специально разработаны для идентификации Оксидаза-негативных, факультативных Гр (-) анаэробов (Enterobacteriaceae). Ниже на диаграмме демонстрируется как Оксидазный тест,  BBLII или BBLII могут быть использованы для идентификации практически всех аэробных и факультативных анаэробных Гр (-) клинически значимых микроорганизмов.

(1) МакКонки Агар

NOTE: Указанные виды (см. стр.6 оригинальной инструкции) плохо растут на МакКонки Агаре

(2) BBL Оксидазный реагент в каплях

(3) BBL II - для идентификации окислительно-ферментирующих Гр(-) бактерий.

(4)  Наиболее распространенные биотипы этих групп могут быть идентифицированны с помощью BBL II. Смотри раздел “Оксидаза-негативные неферментирующие”

(5) Оксидаза-позитивные Гр(-) бактерии могут быть идентифицированы с использованием BBL II или др. систем идентификации. BBL II не рекомендуется использовать для рутинной идентификации этого вида бактерий.

После инкубации BBLII.

1. Интерпретируйте все реакции (кроме индола), сравнивая соответствующие лунки BBL II и цвет лунки на картинке в упаковочном вкладыше или с аналогичными лунками неинокулированной BBL II.

2. Добавте реагент ковачека для интерпретации индол-теста

3. Обозначте каждую положительную реакцию обведя соответствующее число на кодовой карточке ниже лунки. (Используйте белые листочки если VP-тест используется только как подтверждающий и голубые - если как прямой тест, результат которого включается в идентификационный номер.)

4. Просуммируйте цифры положительных реакций и внесите их в 5 квадратиков.

5. Найдите полученный 5-ти значный код в Соответствующей базе данных на 53 стр или на 95 стр. Если номеру соответствует 2 или более организмов проведите необходимые подтверждающие тесты.