Стандартные (классические) методы выявления сальмонелл

Стандартные (классические) методы выявления сальмонелл.
При классическом (стандартном) анализе выявления сальмонелл в пищевом продукте руководствуются действующим ГОСТ Р 52814-2007 (ISO 6579:2002) [4, 25]. Стандартный метод (рис. 1) выполняется в строгом соответствии с требованиями техники безопасности, предусмотренными санитарными правилами при работе с микроорганизмами IV группы патогенности (CП 1.3.2322-08). Особенности отбора проб пищевых продуктов для анализа, методы их транспортировки и подготовки к исследованиям описаны в методических указаниях [10]. Кратность производственного микробиологического контроля различных пищевых продуктов на содержание сальмонелл проводится в соответствии с требованиями санитарных правил [19]. 

Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде.
Используемая для предобогащения сальмонелл забуференная пептонная вода богата питательными веществами, что обеспечивает интенсивный рост даже угнетенных бактерий. Фосфатный буфер стабилизирует рН среды и оптимизирует рост сальмонелл. Соотношение между массой исследуемого продукта (здесь и далее – 25 г) и объемом среды должно быть 1:10. При анализе отдельных пищевых продуктов (сыр, шоколад, конфеты, мед, специи и др.) на этапе предобогащения используют забуференную пептонную воду или иную питательную среду [24]. Модифицированная пептонная вода и специальные среды позволяют нейтрализовать ингибирующее действие самого продукта. Так, при исследовании шоколада необходимо проводить неселективное обогащение на среде с обезжиренным стерильным молоком, нейтрализующим антимикробное действие какао. При исследовании продукции, содержащей лук или чеснок, в пептонную воду вводят сульфит калия, нейтрализующий ингибирующее действие этих овощей. В противном случае при выявлении сальмонелл в подобных продуктах высока вероятность получения ложноотрицательных результатов. 

При исследовании сальмонелл предварительное обогащение образца удобнее проводить в закрывающихся пластиковых пакетах. Это исключает необходимость подготовки питательной среды, мытья и автоклавирования лабораторной посуды. В пакетах с 225 мл стерильной забуференной пептонной воды проводят и гомогенизацию, и инкубирование анализируемого образца (при 37±1 °С в течение 18–24 ч) [22]. При исходном (1–5 КОЕ/25 г) содержании сальмонелл в анализируемом образце после этапа предобогащения титр бактерий достигает 10²–10⁴ КОЕ/мл [26]. 

Обогащение в селективных жидких средах.
Использование нескольких питательных сред, различающихся по селективности, позволяет унифицировать метод выделения сальмонелл из любых образцов пищевых продуктов, независимо от содержания в них сопутствующих микроорганизмов. Культуральной жидкостью, полученной в результате предварительного обогащения в неселективной жидкой среде, инокулируют среду Раппопорта–Вассилиадиса с соей (RVS-бульон). Параллельно производят селективное обогащение одной из двух сред (по выбору): тетратионатным бульоном Мюллера–Кауфманна (МКТ- бульон) или селенитовой обогатительной средой (ГОСТ Р 53665-2009). Посевы инкубируют при 37±1 °С в течение 24±3 ч. Эти среды, угнетая развитие других энтеробактерий, избирательны для сальмонелл и способствуют их размножению (до 10⁴–10⁶ КОЕ/мл).

Пересев на чашки и предварительная идентификация.
Полученные культуры (см. предыдущий пункт) пересевают на 2 агаризованные дифференциально-диагностические среды, различающиеся по селективности. При этом используют ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-агар), хромогенный Рамбах-агар (эти среды избирательны для сальмонелл и шигелл, но угнетают рост других энтеробактерий) или одну из агаризованных дифференциально-диагностических сред, например, висмут-сульфитный агар или ксилозо-лизиновый агар с Тергитолом-4 (XLT4-агар). 

Выявление сальмонелл на хромогенном Рамбах-агаре.
Принцип селективного определения заключается в ферментации сальмонеллами пропиленгликоля до кислоты. Под действием кислоты смесь рН-индикаторов среды окрашивает колонии сальмонелл в красный цвет. На Рамбах-агаре легко отличить Н₂S-продуцирующие штаммы Citrobacter от сальмонелл: первые синего, вторые – красного цвета, тогда как на XLD-агаре или висмут-сульфитном агаре дифференцировать Н₂S-продуцирующие бактерии с сальмонеллами затруднительно. Дезоксихолат натрия ингибирует рост сопутствующих грамположительных бактерий. Посев инкубируется в аэробных условиях при 37±1 °С в течение 24±3 ч. Колонии сопутствующих колиформных бактерий (Е. соli, Klebsiella pneumoniae) сине-зеленой окраски, колонии Shigella и Proteus – бесцветные либо слегка желтоватые. Таким образом, выросшие на Рамбах-агаре колонии сальмонелл легко отличить от всех других представителей семейства энтеробактерий.

Выявление сальмонелл на высокоселективном XLT4-агаре.
Принцип определения сальмонелл основан на продуцировании бактериями сероводорода при их выращивании на высокоселективном XLT4-агаре. При этом колонии сальмонелл черной или красно-фиолетовой (с черным центром) окраски. Оптимальному росту сальмонелл способствуют пептон, дрожжевой экстракт и лизин; тергитол-4 эффективно подавляет рост протея (в отличие от дезоксихолата в XLD-агаре). Это практически полностью исключает возможность ложноположительных результатов при содержании в пробе Н₂S-продуцирующих штаммов протея. Посев инкубируется в аэробных условиях при 35–37 °С в течение 18–24 ч. Выявление бактерий на XLT4-агаре хорошо дополняет исследования, выполненные на Рамбах-агаре. Селективное выявление сальмонелл – важное преимущество XLT4-агара при исследовании таких продуктов, как мясной фарш, содержащий большое количество сопутствующей микрофлоры [6]. 

Биохимическая и серологическая идентификация.
Полученные на агаризованных средах колонии, предположительно относящиеся к сальмонеллам, выделяют для последующей биохимической идентификации. При этом удобно использовать наборы уже готовых стандартных тест-систем [4], например, систему Crystal [27]. Идентификатор микроорганизмов Crystal позволяет определять более 500 видов микроорганизмов, включая разные виды сальмонелл и других энтеробактерий. Основу системы составляют диагностические тест-панели с субстратами. Они позволяют по биохимическому профилю определить вид исследуемого организма. Преимуществами системы являются одноэтапное внесение исследуемого материала, отсутствие дополнительных реагентов, удобство, безопасность и точность исследования, а также экономичность метода. Окончательное подтверждение принадлежности выявленной культуры к сальмонеллам проводят согласно ГОСТ Р 53665-2009 [6].