Ускоренные методы выявления сальмонелл

Ускоренные методы выявления сальмонелл
Существенным недостатком классического метода выявления сальмонелл является длительность исследований. Альтернативные методы позволяют существенно сократить время обнаружения этих бактерий [5, 6, 10, 22].

Полужидкая среда MSRV официально рекомендована для ускоренного выявления сальмонелл [6]. Принцип селективного определения этих бактерий на среде MSRV – выявление подвижности сальмонелл в полужидкой среде и образование ими светлой непрозрачной зоны роста – феномен роения. Рост сопутствующих бактерий ингибируется введением новобиоцина, наличием хлорида магния, малахитового зеленого и инкубацией при повышенной температуре – 41,5 °С (ГОСТ Р 53665-2009). 

Отсутствие этапа селективного обогащения позволяет сократить общее время исследования на 24–48 ч. После предварительного обогащения исследуемый образец (0,1 см³) добавляют в центр чашки Петри со средой MSRV (или по 0,03 см³ в 3 местах на чашке Петри). Посев инкубируют крышкой вверх при 41,5±1 °С в течение 12–18 ч в аэробных условиях. При наличии сальмонелл в анализируемом образце вокруг места посева отмечается диффузный рост колоний подвижных штаммов сальмонеллы в толще этой среды (от центра к периферии), окруженных светлым ореолом – зоной подвижности колоний [6]. С края зоны подвижности колоний берут материал для пересева на дифференциально-диагностические среды [4]. При наличии на среде MSRV роста колоний в форме пуговки проводят их биохимическую идентификацию на возможную причастность к неподвижным сальмонеллам (S.pullorum, S. gallinarum).
 
Преимущества метода – сокращение времени исследования на 24–48 ч (за счет совмещения этапа селективного обогащения с этапом высева на агаризованную среду), высокая чувствительность, обеспечивающая выявление даже единичных клеток сальмонелл и экономичность метода.

Двухкомпонентная среда Salmosyst^® официально рекомендована для применения в лабораториях Роспотребнадзора и производственных лабораториях [14]. Первый этап включает неселективное обогащение имеющихся в образце бактерий на среде Salmosyst^® Broth Base (инкубирование при 35 °С в течение 6–8 ч). По окончании 1-го этапа к 10 см³ среды добавляют 1 таблетку Salmosyst Selective Supplement, что обеспечивает селективный рост сальмонелл. Посев инкубируют при 35 °С в течение 18–24 ч в аэробных условиях. Для идентификации сальмонелл культуру высевают на дифференциально-диагностические среды. Существенное сокращение продолжительности этапа неселективного обогащения обеспечивается исследованием большого объема аликвоты культуральной среды (10 см³, а не 0,1 см³), а также повышенной буферной емкостью среды Salmosyst за счет высокого содержания карбоната кальция (10 г/л), обеспечивающего оптимальную для роста сальмонелл нейтральность среды (рН 7). 

Преимущества метода – сокращение времени исследования на 24–48 ч, высокая чувствительность (выявляются даже поврежденные клетки сальмонелл), простота выполнения анализа и экономичность.

Иммунохроматографические экспресс-тесты Singlepath^®-Salmonella одобрены ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора» и рекомендованы для выявления сальмонелл в пищевых продуктах и кормах [14]. Экспресс- тесты Singlepath^®-Salmonella в течение ряда лет успешно применяются для сертификации пищевой продукции в микробиологических лабораториях Роспотребнадзора и независимых лабораториях. В исследованиях Санкт-Петербургской городской ветеринарной лаборатории [11] при выявлении сальмонелл в 120 образцах мяса птицы тесты Singlepath^®-Salmonella и референтный метод [3] показали высокую сходимость результатов.

Принцип селективного определения сальмонелл с использованием экспресс-тестов Singlepath^®- Salmonella основан на реакции антигенов сальмонелл с высокоспецифичными антителами теста. После этапа селективного обогащения на среде Раппопорта–Вассилиадиса (RVS) аликвота обогащенной пробы (2 см³) термически инактивируется, после чего 0,16 см³ вносят в лунку тест-планшета. Содержащиеся в пробе антигены сальмонелл взаимодействуют с моноклональными антителами экспресс-теста, образуя окрашенный комплекс антиген–антитело, выявляемый визуально.

Результат экспресс-теста считывают уже через 20 мин после внесения пробы. Если красная линия присутствует в тестовой (Т) и контрольной (С) зонах планшета, результат считают положительным; при ее присутствии только в С-зоне – отрицательным (рис. 5). При получении положительного ответа высевают культуральную жидкость на дифференциально-диагностические среды. Отрицательный ответ является окончательным и свидетельствует об отсутствии сальмонелл в анализируемом продукте. Таким образом, экспресс-тест Singlepath^®- Salmonella позволяет выявлять сальмонеллы в образце сразу после этапа селективного обогащения, не прибегая к дополнительным пересевам на дифференциально-диагностические среды.

Экспресс-тест Singlepath^®-Salmonella можно использовать и как подтверждающий при идентификации характерных по морфологии колоний сальмонелл. Время исследования в этом случае также составляет 20 мин.

Преимуществами метода являются значительное сокращение времени исследований (на 48 ч), высокая специфичность и надежность определения. Метод не предусматривает сложных процедур пробоподготовки, использования каких-либо дополнительных приборов или устройств.

В сфере пищевой микробиологии в последние годы все шире применяют методы молекулярно-генетического анализа, в частности метод ПЦР [8, 23]. В процессе анализа in vitro амплифицируется ДНК сальмонелл. Мишенью для амплификации служат специфичные фрагменты нуклеиновых кислот патогена. Принципиальная особенность применения метода Real-Тime PCR – возможность детекции продуктов амплификации ДНК бактерии в динамике непосредственно в процессе проведения реакции. Анализ Real-Тime PCR осуществляется на амплификаторе, который выполняет циклы нагрева и охлаждения образца в заданном диапазоне температур и регистрирует флуюресценцию, соответствующую количеству образовавшихся ампликонов. Процедура ПЦР-анализа пищевой продукции по выявлению сальмонелл и других патогенных микроорганизмов регламентируется ГОСТ Р ИСО/МЭК-17025 [5]. 

Выявление сальмонелл в пищевых продуктах методом Real-Тime PCR позволяет определять наличие в них сальмонелл с высокой селективностью и чувствительностью (в анализируемом образце выявляются единичные клетки сальмонеллы!).
Метод включает 3 обязательных этапа:
1) неселективное обогащение исследуемого образца, которое позволяет исключить ложноположительные результаты при детекции ДНК нежизнеспособных клеток) [23]; 
2) пробоподготовку (экстракция ДНК из обогащенной культуры); 
3) детекцию ДНК сальмонеллы в автоматическом режиме на термоциклере. 

Наряду с этим система позволяет также идентифицировать колонии сальмонелл с агаризованных сред в течение 2 ч. Компания Мерк (Германия) производит тесты для Real-Тime PCR – foodproof Salmonella. Эти тесты защищены международными сертификатами и лицензиями на право их использования в коммерческих целях для анализа сальмонелл [27]. 

Таким образом, метод Real-Тime PCR, позволяет обнаружить сальмонеллы в анализируемом объекте по наличию их ДНК, т.е. без выделения в чистой культуре. Метод обеспечивает автоматическую регистрацию результатов, характеризуется высокой производительностью, чувствительностью и селективностью. Однако для его реализации необходимы значительные затраты средств на приобретение амплификатора, дополнительное обустройство аналитической лаборатории, повышенные требования к ее чистоте [26].