Молекулярные методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (метод ПЦР)

Молекулярные методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот
Эти методы стали переломным этапом в развитии микробиологической диагностики. В качестве мишени они используют уникальный для данного возбудителя короткий участок ДНК или РНК. Этот специфический участок генома распознается с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров (затравок) и многократно копируется (амплифицируется) комплексом ферментов. Накопление такого продукта свидетельствует о положительном результате и происходит в геометрической прогрессии, по экспоненте. В результате даже при наличии минимального исходного количества возбудителя – теоретически одной копии его генома – в процессе 1–2 ч амплификации происходит накопление продукта реакции, превышающее исходное количество фрагментов генома в миллионы и миллиарды раз.

Методы диагностики микроорганизмов на основе амплификации нуклеиновых кислот обладают наибольшей аналитической чувствительностью, что позволяет обнаружить даже минимальное количество микроорганизмов в исследуемом материале. Специфичность реакции определяется олигонуклеотидными праймерами – короткими (18–30 оснований), искусственно синтезируемыми молекулами РНК. Праймеры разрабатываются на основе информации о структуре генома возбудителя таким образом, чтобы обеспечить их взаимодействие со строго специфичным участком генома целевой бактерии. 

Полимеразная реакция (Метод ПЦР)
Метод появился в середине 1980-х годов и очень быстро стал главным в фундаментальных исследованиях нуклеиновых кислот и в ДНК-диагностике [1, 9]. Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает: плавление (образование одноцепочечных молекул) ДНК-мишени при температуре выше 90 °С; отжиг (гибридизация) на каждой одноцепочечной молекуле ДНК комплементарного олигонуклеотидного праймера при 55–65 °С и достройку (синтез) фрагмента двухцепочечной молекулы ДНК термостабильной ДНК-полимеразой при 72 °С [4]. Соблюдение высокой точности при воспроизведении указанных температурных режимов цикла амплификации вынуждает использовать конструктивно сложные и дорогостоящие устройства – прецизионные программируемые термоциклеры (амплификаторы). По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени (при проведении n циклов количество фрагментов ДНК-мишени будет составлять 2n). На практике для получения ампликонов (продуктов амплификации) в количестве, достаточном для их детектирования обычными аналитическими методами, необходимо около 30 циклов амплификации.

До недавнего времени наиболее распространенным методом детекции ампликонов являлся горизонтальный электрофорез в агарозном геле образца реакционной смеси после амплификации [9]. Результат ПЦР считался положительным при выявлении фрагмента ДНК, соответствующего по своей молекулярной массе ампликону контрольного образца. Существенными недостатками этого метода детекции оказались субъективность оценки результатов электрофореза, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР.

Главным недостатком, затрудняющим использование классической ПЦР в диагностической практике, являлась необходимость манипуляций с продуктами амплификации. Ведь при крайне высокой чувствительности ПЦР всегда существовал значительный риск получения ложноположительных результатов из-за перекрестной контаминации исследуемых образцов [6].

Перечисленных недостатков лишена ПЦР в реальном времени – Real-Time PCR (ПЦР-РВ) [7]. В данном случае процессы амплификации и детекции ампликонов происходят одновременно в одной пробирке. Это практически полностью исключает загрязнение ампликонами рабочих помещений и сводит риск получения ложноположительных результатов к абсолютному минимуму.

Для детекции ампликонов в ПЦР-РВ наиболее широко используются методы гибридизационно-флуоресцентной детекции [7]. При этом амплифицированная ДНК гибридизуется с праймерами и с меченными флуоресцентным красителем олигонуклеотидными зондами. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным детектором.

Важное преимущество ПЦР-РВ – количественная оценка числа копий ДНК целевого микроорганизма в исследуемом материале. Однако для реализации этого метода необходимы еще более сложные, чем для классической ПЦР устройства, специальные термоциклеры с прецизионной оптикой, позволяющие мониторировать интенсивность флуоресценции реакционной смеси. Современные термоциклеры для ПЦР-РВ оснащены каналами для детектирования флуоресценции в нескольких диапазонах длин волн, что позволило разработать мультиплексные форматы реакции [1, 9].

Альтернативные методы амплификации ДНК 
ПЦР – наиболее распространенная, но не единственная реакция, основанная на методе амплификации нуклеиновых кислот. На рубеже 1990-х годов стали использовать целый ряд других реакций амплификации. В их числе лигазная цепная реакция, амплификация со смещением цепи, технология циклирующей пробы, самоподдерживающаяся репликация, QP-репликазная амплификация, разветвленная гибридизационная проба и др. [9, 10].

Одним из перспективных вариантов амплификации со смещением цепи является изотермическая амплификация посредством образования петель (LAMP – loop-mediated isothermal amplification). Конечный продукт данной реакции представляет собой специфические структуры, состоящие из нескольких перевернутых повторяющихся последовательностей оригинального ДНК-шаблона, соединенных петлями одноцепочечной ДНК. В данном методе ДНК амплифицируется непрерывно с высокой скоростью и специфичностью при постоянной температуре. LAMP использует ДНК-полимеразы с высокой активностью смещения и четыре праймера, что повышает специфичность реакции. На основе изотермической амплификации уже созданы коммерческие тест-системы для диагностики возбудителей некоторых заболеваний [8].