Система молекулярного обнаружения патогенов – 3M™ Molecular Detection System

Система молекулярного анализа – 3M™ Molecular Detection System
Американская компания 3М, выпускающая тест-системы для контроля безопасности пищевых продуктов и сырья, на основе метода изотермической амплификации со смещением цепи разработала Систему молекулярного анализа – 3M™ Molecular Detection System [4]. Система предназначена для обнаружения в продуктах питания патогенных микроорганизмов, таких как Salmonella, Listeria spp., Listeria monocytogenes и E. coli O157. 

3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) – это сочетание инновационной технологии изотермической амплификации ДНК с биолюминесцентной детекцией продуктов амплификации, что позволило сделать метод точным, экспрессным, простым в использовании и экономически доступным. Процедура анализа включает три этапа: предварительное обогащение исследуемого образца в жидкой питательной среде, лизис бактериальных клеток, амплификацию с детекцией продуктов реакции в режиме реального времени.

Обогащение образца проводят в течение 24 ч в стерильной забуференной пептонной воде при выявлении Salmonella и E. coli O157 или в селективном бульоне при выявлении Listeria spp. и Listeria monocytogenes. Благодаря обогащению в жидкой среде 3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) позволяет определять единичные клетки целевых микроорганизмов в 25 г исследуемого образца.

Лизис обогащенного образца для выделения ДНК проводят простым нагреванием в твердотельном термостате при 100 °С в течение 15 мин с последующим быстрым охлаждением. Реакция проводится в специальных пробирках, входящих в состав тест-набора. Упрощенная процедура лизиса сокращает количество этапов анализа и становится возможной потому, что Bst-полимераза, которая используется в тест-наборе, менее требовательна к качеству ДНК-матрицы по сравнению с Taq-полимеразой, используемой в ПЦР-системах. Амплификация и детекция базируются на уникальном сочетании изотермической амплификации и биолюминесцентной детекции (см. рисунок и таблицу).

Амплификация целевого фрагмента осуществляется Bst-полимеразой, активность которой вдвое выше, чем у Taq-полимеразы (120 и 60 п.н./с соответственно) [3]. Кроме того, Bst-полимераза менее чувствительна к ингибирующему влиянию компонентов образца и менее требовательна к качеству ДНК-матрицы, что обеспечивает большую стабильность реакции и упрощает пробоподготовку.

Реакция осуществляется по механизму амплификации со смещением цепи, что дает преимущество с точки зрения высокой эффективности непрерывной амплификации ДНК в условиях постоянной температуры. Нижний предел обнаружения составляет всего несколько копий. Присутствие в реакционной среде нецелевых участков ДНК не влияет на результат анализа. Изотермическая амплификация – это простой, легко реализуемый и высокоселективный метод. Высокая специфичность достигается благодаря использованию четырех праймеров. Постоянная температура реакции исключает необходимость использования дорогостоящего оборудования для воспроизведения температурных циклов, что существенно уменьшает стоимость исследования.

Индикация реакции амплификации осуществляется при помощи биолюминесценции. При полимеризации нуклеотидтрифосфатов в молекулу ДНК в большом количестве образуются молекулы пирофосфата, которые АТФ-сульфурилаза превращает в молекулы АТФ. В свою очередь, термостабильная люцифераза преобразует энергию АТФ в световое излучение, которое и является маркером реакции. Прибор регистрирует световое излучение в процессе амплификации в режиме реального времени, что существенно упрощает процедуру анализа, устраняет необходимость дальнейших манипуляций с продуктами амплификации, сводит к минимуму вероятность ложноположительных реакций из-за перекрестной контаминации. Биолюминесцентная детекция продуктов амплификации характеризуется лучшим соотношением «сигнал/шум» по сравнению с флуоресценцией. На интенсивность биолюминесцентной детекции не влияют помехи от флуорофоров, присутствующих в некоторых продуктах или средах обогащения (например, акрифлавин). Кроме того, использование биолюминесцентной индикации исключает необходимость приобретения дорогостоящих источников возбуждения света, флуорофоров, флуоресцентных фильтров и детекторов. За счет этого повышается надежность работы прибора и существенно уменьшаются затраты на его обслуживание.

Несмотря на сложность молекулярного обоснования, метод прост в исполнении. Лизированный образец вносится в пробирки с набором реагентов, после чего их помещают в амплификатор, подключенный к ПК со специальной программой. К одному ПК можно подключать до четырех приборов. Прибор за один цикл позволяет исследовать от 1 до 96 образцов. Кроме того, одновременно можно выявлять несколько патогенов в образце, поскольку процедура амплификации унифицирована: меняются только пробирки с набором необходимых реагентов. Пробирки с реагентами для определения указанных патогенов имеют разную цветовую маркировку, что исключает возможные ошибки. Полный цикл амплификации занимает 75 мин, однако при положительном результате ответ будет получен уже через 15 мин. С учетом этапа неселективного обогащения общая продолжительность анализа составляет 20–28 ч, что на 48–72 ч быстрее в сравнении с классическим бактериологическим методом.

3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System), предназначенная для экспрессного выявления ключевых возбудителей пищевых инфекций – сальмонелл, листерий, Listeria monocytogenes и E. coli O157, представляет большой интерес для специалистов санитарно-эпидемиологической и ветеринарной служб, работников производственных лабораторий, осуществляющих контроль и скрининг патогенных микроорганизмов в продуктах питания, сырье, объектах производственной среды.

Это современный, экономичный, простой в использовании, высокочувствительный и высокоспецифичный молекулярный метод обнаружения патогенов. Метод прошел этап валидации (в соответствии с ИСО 6579) и сертифицирован компетентной международной организацией AFNOR для выявления сальмонелл в яйцах, мясных, молочных и морепродуктах. Он сертифицирован международной организацией АОАС для выявления энтерогеморрагической кишечной палочки (E. coli O157) и бактерий рода Listeria в пищевых продуктах и напитках [2, 4]. 3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) – это целостная система, готовая к использованию и не требующая дополнительных вложений. Система широко используется более чем в 33 странах, включая ЕС и США, и представляет большой интерес для использования в России при экспрессном контроле качества продуктов питания и сырья.