Статья: "Сравнительная оценка 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) со стандартными методами исследования (DIN EN ISO) по выявлению Listeria monocytogenes и Salmonella enteritidis"

Сравнительная оценка 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) со стандартными методами исследования (DIN EN ISO) по выявлению Listeria monocytogenes и Salmonella enteritidis 

Pfannebecker J., Becker B.
Университет прикладных наук, Институт пищевых технологий, Lemgo, Германия

В исследовании представлены результаты оценки молекулярного метода обнаружения патогенов в пищевых продуктах с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) в сравнении со стандартными методами выявления Salmonella enteritidis (ISO 6579) и Listeria monocytogenes (ISO 11290-1). Основой молекулярного метода 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) является сочетание методик изотермической амплификации ДНК и биолюминесцентной детекции после этапа обогащения микроорганизмов. Использование изотермической амплификации ДНК в комбинации с биолюминесцетной детекцией обеспечивает высокую чувствительность метода. Общее время анализа на 3М Системе молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection Systerm) составляет 75 мин, время обогащения образца – 18-48 ч. Общее количество естественно и искусственно загрязненных сальмонеллами и листериями образцов составило 155 (мясо, деликатесы, специи, какао-порошок, сухое молоко). За исключением анализа смеси специй, никаких различий по результатам анализа метода с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) и стандартными методиками не выявлено. 

Введение
3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) – это система молекулярного обнаружения патогенов - Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coli О157:Н7. Система разработана для выявления бактерий в различных пищевых продуктах, таких как мясо, полуфабрикаты, готовая продукция, фрукты, овощи, корма для животных и образцы смывов с поверхности. В данном исследовании приведены результаты выявления патогенов в образцах мяса, деликатесов, специй, сухого молока и какао-порошка с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System).

Материалы и методы
155 образцов (72 естественно и 83 искусственно (10² КОЕ/г) загрязненных патогенами) исследовались на содержание Salmonella enteritidis (DIN EN ISO 6579) и Listeria monocytogenes (DIN EN ISO 11290-1) – Табл. 1.

Таблица 1. Количество образцов продуктов, исследованных на наличие патогенов 

Обогащение образцов, а также анализ на 3М Системе молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) выполняли в двух повторностях. После этапа обогащения (18 ч) образцы анализируются на автоматическом устройстве в реальном времени в течение 75 минут. Прибор прост в эксплуатации, подготовка образца включает всего несколько этапов (рис. 2).

3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System), методика:

1) Обогащение образца. Образец продукта + обогатительный бульон (1:10), инкубировать при 37 ^оС, 18-48 ч.
2) Лизис клеток. Внести 20 мкл обогащенного образца в пробирку для лизиса, нагреть при 100^оС 15 мин, охладить 10 мин, встряхнуть 3-5 раз, оставить на 5 мин.
3) Гидратирование реагентов. Внести 20 мкл лизата в реагентную пробирку с лиофилизованными реактивами.
4) Амплификация и детекция. Поместить пробирки в прибор и нажать кнопку «старт»; продолжительность амплификации 75 мин. Результаты в виде цветных кривых отображаются на экране в режиме реального времени.

Общее время исследования сальмонелл молекулярным методом с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) составляет менее 20 ч, что в 4,5 раза быстрее по сравнению с классическим методом (DIN EN ISO) (90-96 ч).

Результаты
Опыты с искусственно зараженными образцами показали, что даже при низком содержании клеток (10² КОЕ/г) при 18 ч обогащении положительный результат регистрируется уже через 20-30 мин после начала амплификации (рис.3). Каких-либо различий в выявлении сальмонелл и листерий в мясе, салатах, сухом молоке и какао-порошке при сравнении результатов 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) и классического метода (DIN EN ISO) не выявлено. Различия между методами выявлены при исследовании смеси специй (табл. 2).

При анализе смеси специй (сельдерей, горчица, перец) с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) (в сравнении с ISO) получили ложноотрицательный результат. В дальнейшем при анализе специй после разбавления образцов (1:100) и последующем проведении этапа обогащения все загрязненные образцы (10² КОЕ/г) были оценены как положительные (данные не приведены). 

В опытах по выявлению предела обнаружения бактерий на 3М Системе молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) в мясе и деликатесах показано, что выявление микроорганизмов в этих продуктах без этапа обогащения возможно лишь при исходной концентрации бактерий свыше 10⁵  КОЕ/г. Таким образом, достоверные результаты по выявлению патогенов можно получить лишь после 18 ч этапа обогащения образцов.

Результаты с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) молекулярного обнаружения патогенов сравнивали со стандартными методами DIN EN ISO. Точность полученных результатов в опытах с сальмонеллой составила 98%, специфичность 100% , а чувствительность 96%; для листерии, точность - 96%, специфичность – 98% и чувствительность - 95%. 

Заключение
При сравнении со стандартным методом DIN EN ISO молекулярный метод с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) показал достоверные результаты при сокращении времени исследования при анализе Listeria monocytogenes и Salmonella enteritidis. Ложноотрицательные результаты при анализе специй можно избежать, изменив этап подготовки образцов.