Кронобактер (Cronobacter spp.)

Cronobacter spp. (Кронобактер)

Бактерии рода Cronobacter spp.(Кронобактер) представляют собой грамотрицательные, факультативно анаэробные, оксидаза-отрицательные, каталаза-положительные, палочки семейства Enterobacteriaceae. Кронобактер обычно подвижны, восстанавливают нитраты, утилизируют цитрат, гидролизуют эскулин и аргинин, декарбоксилируют L-орнитин. Ферментируют D-глюкозу, D-сахарозу, D-раффинозу, D-мелибиозу, D-целлобиозу, D-маннит, D-маннозу, L-рамнозу, L-арабинозу, D-трегалозу, галактуронат и D-мальтозу до кислоты. Как правило, Кронобактер образуют ацетоин (реакция Фогес-Проскауэра) и отрицательны в реакции с метиловым красным.

Известным представителем рода Cronobacter spp. является Cronobacter sakazakii, который до 2007 назывался Enterobacter sakazakii. Cronobacter sakazakii является возбудителем пищевых токсикоинфекций, в основном, у новорожденных. У младенцев он может вызвать бактериемию, менингит и некротизирующий энтероколит, причем с высоким процентом смертности. Эта особенность нашла отражение в названии рода Кронобактер, которое происходит от греческого мифологического бога Кроноса, согласно легенде пожирающего своих детей.

В соответствии с новым стандартом ИСО - EN ISO 22964:2017 необходимо выявлять все бактерии, которые относятся к роду Кронобактер. Кронобактер распространен повсеместно. Некоторые штаммы  способны выживать в высушенном состоянии более двух лет! Большинство случаев инфекции связаны с использованием порошкообразных детских сухих молочных смесей. Внедрение стандартного метода ИСО для обнаружения этих микроорганизмов позволяет осуществлять строгий контроль на производстве детского питания.

Контролю на наличие бактерий Кронобактера подлежат детские молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни. В первую очередь Кронобактер может попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового продукта.

Новый стандарт ИСО 22964 - обнаружение Cronobacter spp (Кронобактер) в пищевых продуктах, сырье, объектах внешней среды

Опубликован новый ИСО стандарт - EN ISO 22964:2017, в котором приводится метод обнаружения Cronobacter spp. (Кронобактер) в пищевых продуктах, кормах, а также объектах внешней среды. Кронобактер является возбудителем пищевых токсикоинфекций. Особую опасность он представляет для новорожденных. У младенцев он может вызвать бактериемию, менингит и некротизирующий энтероколит, причем с высоким процентом летальности.  Большинство случаев инфекции связаны с использованием порошкообразных детских сухих молочных смесей.

Изменения в новом стандарте

1. В новом стандарте ИСО 22964 по сравнению с предыдущим ISO / TS 22964:2006 расширена область обнаружения. Теперь необходимо выявлять все бактерии, которые относятся к роду Кронобактер (Cronobacter spp.), а не только Enterobacter sakazakii (Cronobacter sakazakii). 
2. Модифицированный лаурилсульфатно-триптозный бульон (mLST) заменен на Кронобактер селективный бульон (CSB) .
3. Enterobacter sakazakii селективный агар (ESIA) заменен на Кронобактер хромогенный агар - Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI).  Кронобактер образует типичные колонии на хромогенном агаре (CCI) и имеет характерные биохимические признаки.
4. Внесены изменения в ряд подтверждающих тестов.

Питательные среды для выделения Кронобактера в соответствии с ИСО 22964:

Информация для заказа

Основные этапы выделения Кронобактера

1) Неселективное обогащение
     10 г образца + 90 мл ЗБВ (Забуференная пептонная вода) – 18 ч при 37С

2) Селективное обогащение
     0,1 мл культуральной жидкости + 10 мл CSB (Кронобактер Селективный бульон) –
     24 ч при 41,5С

3) Выделение на хромогенном агаре
    Высев петлей на Кронобактер хромогенный агар (CCI) – 24 ч при 41,5С

4) Подтверждение
    Проверить 1-4 типичные колонии.
    Высев на неселективный триптиказо-соевый агар (TSA) – 24 ч при 37С.
    Биохимический и серологический анализ.

GranuCult™ CSB (Cronobacter Selective Broth) base acc. ISO 22964 –
Кронобактер селективный бульон (основа) в соответствии с ИСО 22964, Кат. № 120597.0500

Бульон для селективного обогащения Cronobacter spp. из пищевых продуктов,  кормов и образцов окружающей среды. Состав среда полностью соответствует EN ISO 22964.

Принцип действия
Ферментативный гидролизат мяса и мясной экстракт, входящие в состав среды, создают условия для хорошего роста Кронобактера. Ванкомицин ингибирует рост грамположительной флоры, хлорид натрия поддерживает осмотический баланс среды.

Кронобактер селективный бульон (CSB) является дифференциальной средой. Ферментация сахарозы, которая вызывается в основном Кронобактером, приводит к изменению цвета индикатора бромкрезолового пурпурного. Однако Кронобактер не всегда вызывает изменение цвета среды при данном времени инкубации. В соответствии с ИСО 22964 необходимо исследовать далее все образцы (независимо от изменения цвета бульона) на Кронобактер хромогенном агаре (CCI).

Состав среды (г/л)
Основа среды: ферментативный гидролизат мяса - 10, мясной экстракт - 3, NaCl - 5, бромкрезоловый пурпурный - 0,04, сахароза - 10.
Селективная добавка: гидрохлорид ванкомицина - 0,01.

Приготовление среды

1. Растворить 14,02 г основы среды CSB в 500 мл деминерализованной воды. Разлить по 10 мл в пробирки. Автоклавировать 15 минут при 121°С.

1. Растворить содержимое одного флакона с селективной добавкой CSB (Кат. № 120595.0010) в 1 мл стерильной деминерализованной воды.

1. Добавить к каждой пробирке с основой среды (температура среды должна быть не более  50°С) 20 мкл CSB селективной добавки.

Конечная концентрация ванкомицина в среде CSB - 10 мг/л.

1 флакон CSB селективной добавки (Кат.№ 120595.0010) содержит 5,0 мг гидрохлорида ванкомицина.

Подготовленная среда прозрачная, фиолетового цвета.

Ход исследования
Согласно ИСО 22964 после этапа неселективного обогащения на забуференной пептонной воде необходимо перемешать флакон с культуральной жидкостью и перенести 0,1 мл культуральной жидкости в 10 мл бульона CSB и перемешать.

Инкубировать пробирки в аэробных условиях при 40,5-42,5°C в течение 22-26 ч.

После этапа селективного обогащения на среде CSB проводят посев штрихом на поверхность Кронобактер хромогенного агара (CCI)согласно ИСО 22964.

Хранение
Среду  хранят при 15-25С в сухом месте, плотно закрытой. Не использовать слежавшуюся или обесцвеченную среду. Защищать от воздействия УФ-света. Приготовленную основу среды можно хранить при 2-8С в темноте, срок хранения до 6 месяцев. Среду с селективной добавкой хранить  при 2-8С не более 1 дня.

Контроль качества

Chromocult CCI (Chromogenic Cronobacter Isolation) agar –
Хромогенный агар для выделения Кронобактера, Кат.№ 120596.0500

Хромогенный агар для селективного выделения Cronobacter spp. (Кронобактер) из пищевых продуктов, кормов и образцов окружающей среды. Состав среда полностью соответствует EN ISO 22964.

Принцип действия
Хромогенная среда содержит хромогенный субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид, для обнаружения фермента α-глюкозидазы. Этот фермент присутствует во всех видах Кронобактера. На хромогенном агаре Кронобактер образует синие и сине-зеленые колонии.

Ростовые и селективные и свойства Chromocult CCI агара обеспечивают хороший рост Кронобактера после этапов неселективного и селективного обогащения. Среда содержит дезоксихолат натрия для ингибирования роста сопутствующей грамположительной микрофлоры. Тиосульфат натрия и цитрат аммония (III) позволяют дифференцировать Кронобактер от других H₂S-продуцирующих  энтеробактерий. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс среды.

Состав среды, (г/л)
Триптоза – 7, дрожевой экстракт – 3, хлорид натрия – 5, 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид – 0,15, дезоксихолат натрия – 0,25, цитрат аммонийного железа – 1, тиосульфат натрия – 1.

Приготовление
Растворить 29,5 г в 1 л деминерализованной воды. Нагревать на кипящей водяной бане, часто перемешивать  до полного растворения. Автоклавировать 15 минут при 121°C.

После охлаждения среды до 45-50°С следует разлить среду по чашкам 18-20 мл. Полученная среда должна быть прозрачной, желтовато-коричневая.

Перед использованием на чашках с агаром не должно быть влаги. Если конденсат присутствует, то чашки следует подсушить, в соответствии с EN ISO 11133.

Ход анализа
Согласно стандарту ИСО 22964 посев проводят после селективного обогащения на CSB бульоне (Кронобактер селективный бульон) петлей (10 мкл) на поверхность хромогенного CCI агара  для получения хорошо изолированных колоний. Перед посевом культуральную жидкость тщательно перемешивают.

Чашки инкубируют перевернутыми в аэробных условиях, при 40,5-42,5 ° C в течение 22-26 часов. После инкубации на хромогенном CCI агаре проверяют наличие типичных колоний Кронобактер.

На CCI агаре Кронобактер образует мелкие и средние колонии (от 1 мм до 3 мм) синего и сине-зеленого цвета. Колонии других микроорганизмов (не Кронобактер) часто бывают белыми или белыми с зеленым центром, серые или черные. Некоторые пигмент-образующие, которые не относятся к Кронобактер могут быть желтыми или красными.

Предварительные результаты наличия Кронобактера должны подтверждаться путем проведения тестов, указанных в ИСО 22964.

Хранение
Среду  хранят при 15-25С в сухом месте, плотно закрытой. Не использовать слежавшуюся или обесцвеченную среду. Защищать от воздействия УФ-света. Чашки с готовой средой хранят при 2-8С в темноте, следует избегать высыхания агара, срок хранения 14 дней.

Контроль качества